《分子生物学实验》教学大纲
2019.12
课程名称：分子生物学
课程代码：107032319C
课程性质：必修
总学时：27
学 分：1.5
适用专业：生物科学专业
先修课程：生物分析化学、生物化学、微生物学、遗传学
一、课程的性质、目的与任务
分子生物学实验课程的设立为系统培养学生在分子生物学领域基本技术和技能，通过学生的独立实验操作和实践，培养学生的创新思维和独立分析问题、解决问题的能力。
二、教学内容与教学基本要求
序号 |
实验名称 |
时数 |
实验 类型 |
课程内容 |
教学要求 |
1 |
酵母RNA的粗提取及组分鉴定 |
5 |
基础性 |
1.熟悉离心机的使用 2.磷酸、戊糖和碱基的鉴定 |
掌握真核生物RNA的存在形式及分离和提取方式以及鉴定核糖、磷酸和戊糖的方法 |
2 |
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离小麦过氧化物同工酶 |
7 |
综合性 |
1.聚丙烯酰胺分离胶和浓缩胶的制备 2.垂直板电泳槽的安装及使用 3、电泳仪的连接和使用 4、冷冻离心机的使用 |
掌握浓缩胶和分离胶的组分及配置方式，掌握灌胶方法及垂直板电泳槽的安装，学习冷冻离心机的设置及使用，掌握电泳仪和电泳槽的连接及设置方式。 |
3 |
CTAB法提取小麦基因 |
5 |
综合性 |
1. CTAB溶液的配置 2. 植物DNA的提取 |
掌握植物DNA的提取方式，熟悉微量移液器的使用，掌握DNA的保存方式 |
4 |
PCR扩增小麦基因 |
4 |
综合性 |
1. 样品的制备 2. PCR仪的设置及使用 |
了解PCR的反应原理，学习PCR反应体系的制备，掌握PCR仪的程序设定及使用 |
5 |
琼脂糖凝胶电泳分离小麦持家基因 |
3 |
综合性 |
1. 琼脂糖凝胶的制备 2. 水平电泳槽的连接和使用 3. 紫外检测仪的使用 |
掌握琼脂糖凝胶的制备及电泳过程，掌握紫外检测仪、凝胶成像系统的使用以及判定DNA分子大小的方法 |
6 |
大肠杆菌感受态细胞的制备 |
3 |
综合性 |
1. 超净工作台、恒温摇床的使用 2. 无菌操作的规范操作 |
掌握感受态细胞的制备过程，熟悉无菌操作流程 |
三、成绩评定
1.通过学生的平时成绩进行考核。平时成绩包括实验态度、实验室常识、实验技能的掌握，同时结合实验报告等方面。
2.考核学生的独立实验设计和实践过程，注重学生的创新性思维及独立分析问题解决问题能力的提高。
3.总成绩= 实验报告成绩（100%）
四、教学参考书
1．梁宋平主编. 生物化学与分子生物学实验教程.高等教育出版社
2. 张维铭主编. 现代分子生物学实验手册. 科学出版社
3. 雷东锋主编. 现代生物化学与分子生物学仪器与设备. 科学出版社
五、说明
本教学大纲针拟在生物科学专业教学中实行，在实践教学中将根据教学指导思想逐步修订完善。实际开设实验个数根据具体情况实施
实验一 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定
一、实验目的：
1、了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法
2、学习稀碱法提取RNA的基本原理和具体方法
二、实验原理：
酵母核酸中RNA含量较多，而DNA含量较少，RNA溶于稀碱溶液，不溶于一般的有机溶剂如乙醇、乙醚等，可用此法沉淀核酸。在碱提取液中加酸性乙醇可使解聚的核糖核酸沉淀（RNA的PI=2.5~3.5之间），从而得到RNA的粗制品。RNA在浓酸条件下水解得到磷酸、戊糖和碱基。戊糖遇苔黑酚呈绿色；嘌呤遇AgNO3产生白色嘌呤银化合物沉淀；磷酸遇定磷试剂呈现蓝色。
三、试剂与器材：
试剂：
1、0.04mol/L NaOH |
2、3% AgNO3 |
3、95%乙醇 |
4、乙醚 |
5、浓氨水 |
6、10%H2SO4 |
7、酸性乙醇：0.3mL浓盐酸加入到30mL乙醇中 |
8、Fecl3-浓Hcl：2mL10% Fecl3加到400mL浓盐酸中 |
9、苔黑酚乙醇溶液：6g苔黑酚溶于100mL95%乙醇中 |
10、市售安琪酵母 |
11、定磷试剂——1、17%硫酸：17mL浓硫酸缓缓倒入83mL水中 2、2.5%钼酸铵：2.5g钼酸铵溶于100mL水中 3、10%抗坏血酸：10g抗坏血酸溶于100mL水中 1：2：3：水=1：1：1：2（体积比），使用时现用现配。 |
|
|
|
|
|
|
|
器材：离心机，水浴锅
四、实验步骤：
（一）、RNA的提取
1、称10g干酵母粉置硏钵中，加30mL0.04mol/L NaOH研磨，并全部转移至100 mL三角瓶中，沸水浴30分钟（期间不断搅拌）。
2、冷却后，3000转/分离心15分钟，留上清液。
3、将上清液倒入10 mL酸性乙醇溶液中，边倒边搅拌，用PH试纸调PH=2.5~3.5。 静置几分钟，使RNA完全沉淀。
4、将上述溶液置于离心管中，3000转/分离心3分钟，弃上清液。
5、用95%乙醇洗涤沉淀两次，在原离心管中进行，搅拌并3000转/分离心1分钟，弃上清液。
6、用乙醚洗涤沉淀两次，操作同上步。
7、将沉淀倒在滤纸上干燥，即为 RNA粗品。
（二）、组分鉴定
1、称0.2gRNA粗品置于刻度试管中，加10%H2SO410mL，沸水浴10分钟，得到RNA水解液。
2、鉴定嘌呤碱：2mL水解液+2mL浓氨水+1mL3% AgNO3，静止片刻，观察现象。
3、鉴定核糖：1mL水解液+2mLFecl3-浓Hcl+0.2mL苔黑酚乙醇溶液，沸水浴3分钟，观察现象。
4：鉴定磷酸：1mL水解液+1mL定磷试剂，沸水浴1-2分钟，观察现象。
五、结果与分析：
实验二 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶
一、实验目的
掌握电泳技术的原理、方法和凝胶配制等知识，熟悉主要的操作过程。
二、实验原理
同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构、组成却有所不同的一组酶。植物在发育过程中，所含同工酶的种类和比例都不相同。作为基因表达的产物，测定同工酶谱是认识基因存在和表达的一种工具，在植物的种群、发育和杂交遗传的研究中有重要的意义。
利用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高、重现性强、测定结果便于观察、记录和保存。本实验通过聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术分离小麦幼苗的过氧化物同工酶，根据酶催化的反应，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物同工酶。
1、聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是以丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N,N´-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成的。Acr和Bis在单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。但在具有自由基体系时它们聚合。引发产生自由基的方法有两种——化学法和光化学法。
化学聚合的引发剂是过硫酸铵（Ap），催化剂是N,N,N´,N-四甲基乙二胺（TEMED），在催化剂TEMED的作用下，有过硫酸铵形成的自由基又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。TEMED在低pH时失效，会使聚合作用延迟，冷却也可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合，分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用。这些因素在实际操作时应予以控制。
光聚合以光敏感物质核黄素作为（VB2）催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从容引起聚合作用。
光聚合形成的凝胶孔径较大，而且随着时间的延长而逐渐变小，不太稳定，所以用它制备大孔径的浓缩胶较为合适。采用化学聚合形成的凝胶孔径较小，而且重复性好，常用来制备分离胶。
聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。每100mL凝胶溶液中含有的单体和交联剂的总质量称为凝胶浓度，用T%表示。凝胶溶液中，交联剂占单体和交联剂总量的百分数称为交联度，用C%表示。改变凝胶浓度以便适应各种样品的分离。一般常用7.5%浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，而用2.4%浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离核酸。
2、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理
系统的不连续性表现在以下几个方面：1）凝胶板由上下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。本实验采用碱性系统，电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶缓冲液为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。3）在电场中形成不连续的电位梯度
不连续电泳之所以有很高的分辨率是因为有三种效应：即浓缩效应、电荷效荷和分子筛效应。在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好的分离开来。
浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。其原因如下：1）虽然样品胶和浓缩胶都是用的Tris – HCl缓冲液，但pH不同；电泳时，由于HCl是强电解质，不管在哪层胶中，几乎都完全电离，Cl–布满整个胶板。；而在电泳槽中的Tris –甘氨酸缓冲液是pH8.3，因为甘氨酸的等电点为6.0，在电泳过程中，它只有极少数分子（1 ％ ～0.1 ％）解离成H2N—CH2—COO–。一般酸性蛋白质在此pH值下也解离为带负电荷的离子，但其解离度比 HCl 小，比甘氨酸大。这三种离子带有同性电荷，在一定的电场作用下，它们的泳动率是不一样的。而且它们的有效泳动率是按下列次序排列的，即：Cl–＞蛋白质＞甘氨酸。根据有效泳动率的大小，最大的称为快离子（或先行离子），最小的称为慢离子（或随后离子）。电泳一开始，有效泳动率最大Cl–迅速跑到最前边成为快离子，甘氨酸有效泳动率最低，跑在最后，成为慢离子，二者之间就形成了一个不断移动的界面，酶蛋白有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一起区带。
由于快离子的泳动率最大，在快离子后面就形成一个离子浓度低的区域，即低电导区。电导与电势梯度是成反比的，所以低电导区就产生了较高的电势梯度。这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。因而在高电势梯度区和低电势梯度区之间形成一个迅速移动的界面（图 36-1 ）。由于样品中蛋白质的有效泳动率恰好介于快、慢离子之间，所以也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩成一狭小的样品薄层。这就是所谓的浓缩效应。在此区带中，各种酶蛋白又按其电荷而分成不同层次，在进入分离胶前被初步分离，形成若干条离地很近但又不同的“起跑线”。
图 3-1 不连续电泳浓缩效应示意图
电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定的电极、以一定的速率移动。
分子筛效应：分离胶的孔径较小，相对分子质量或构型不同的蛋白质通过分离胶，所受摩擦力不同，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的泳动率，即所谓的分子筛作用。即使净电荷相似，泳动率相等的蛋白质分子也会由于分子筛效应在分离胶中被分开。相对分子质量小、形状为球形的分子在电泳过程中受到的阻力较小，移动较快；反之相对分子质量大、形状不规则的分子在电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。
三、实验用品
（一）材料：小麦幼苗
（二）器材：垂直板电泳槽及附件（玻璃板、电泳槽、梳子、导线等）、稳压稳流直流电泳仪、高速冷冻离心机、微量移液器、烧杯、玻璃棒、大培养皿等
（三）试剂
2%琼脂、分离胶缓冲液（pH8.9Tris-HCl缓冲液）、浓缩胶缓冲液（pH6.7Tris-HCl缓冲液）、分离胶储液、浓缩胶储液、过硫酸铵、TEMED、核黄素、电极缓冲液（pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液）、40%蔗糖溶液、样品提取液（pH8.0Tris-HCl缓冲液）、0.5%溴酚蓝溶液、Vc-联苯胺染色液
四、实验步骤
（一）、电泳槽的安装
将玻璃板洗净，再用蒸馏水冲洗，直立干燥。干燥后在玻璃板两侧连续涂上凡士林，然后安装在电泳槽上，用夹子固定，底部用2%琼脂封底。电泳槽的垂直平面两侧各有一个硅胶条，在玻璃板和电泳槽的垂直平面之间距离约为1.5mm，这样形成一个“胶室“，凝胶液就在这两板之间的胶室内聚合成平板胶，待琼脂凝固后即可灌制凝胶。
（二）凝胶的制备
将储液从冰箱取出，待与室温平衡后再配制工作液
名称 |
分离胶缓冲液 |
分离胶储液 |
过硫酸铵 |
无离子水 |
体积比例 |
1 |
2 |
4 |
1 |
取用量/mL |
4 |
8 |
16 |
4 |
1、配制分离胶储液
将上述溶液混均后，加入1-2滴TEMED并混匀，然后将分离胶沿玻璃般加入胶室内至适当高度，小心不要产生气泡，立即覆盖2-3mm的水层，静置待聚合（约40分钟），当胶与水层的界面重新出现时表明胶已聚合。
2、配制浓缩胶储液
名称 |
浓缩胶缓冲液 |
浓缩胶储液 |
核黄素 |
蔗糖 |
体积比例 |
1 |
2 |
1 |
2 |
取用量/mL |
2 |
4 |
2 |
4 |
先倒掉分离胶上的水层，立即加入浓缩胶，插入梳子，照光使胶聚合，待胶凝后，小心取出梳子。将稀释10倍的电极缓冲液倒入两槽中，上槽缓冲液要求没过样品槽，下槽缓冲液要求没过电极，准备点样和进行电泳。
（三）样品的制备
称取小麦幼苗茎部0.5g，放入研钵中，加提取液1mL，于冰域中研成匀浆，然后以2mL提取液分2次洗入离心管，于4℃、10000转/分 离心10分钟，倒出上清液，与等量得40%蔗糖混合，留作点样用。
（四）点样
用微量加样器吸取少量样液，每个点样槽加15-50μL。点样时需小心，防止样品液的扩散。
（五）电泳
在上下电泳槽中加入电极缓冲液，并在上槽电极缓冲液中加一滴溴酚蓝，混匀。连接好电源线（上槽为负极）。打开电源开关，调节电流到每个点样孔1mA左右，样品进入分离胶后加大到每孔2mA，维持恒流。待指示燃料下行到距胶板末端1cm处，即可停止电泳，将调节旋钮调至零，关闭电源，电泳约90分钟。
（六）剥胶
倒掉电极缓冲液，取下夹子，掀开玻璃，去掉浓缩胶，用玻璃棒协助将分离胶放到大培养皿中。
（七）染色、记录结果
在大培养皿中加入适量Vc-联苯胺染色液，淹没整个胶板，于室温下显色20分钟，即得到过氧化物酶同工酶得红褐色酶谱。于日光灯下观察记录酶谱，并绘图。
实验三 植物DNA的提取（CTAB法）
一、实验目的
掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。
二、实验原理
核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为DNA和RNA两大类，真核细胞中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。
在浓氯化钠溶液(1～2mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：①用含辛醇或异戊醇的氯仿去除蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积95％乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。③用苯酚处理，然后离心分层，DNA或溶于上层水相，或存在于中间残留物中，蛋白变性后则停留在酚层内。吸出上面水层，将其注入两倍体积的95％乙醇溶液中，得到白色纤维状DNA沉淀。反复多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。
核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH值4.0—11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。②物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性。又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂，不利于收集，③酶的作用，核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，会降解DNA。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。SDS和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。
CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子表面活性剂（去污剂）能与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，但不能沉淀核酸。本实验利益CTAB的高盐溶液提取植物基因组DNA，先将新鲜的叶片在液氮中研磨，破碎其细胞，然后加入CTAB分离缓冲液，将DNA溶解出来，再经氯仿-异戊醇抽提除去蛋白质，再经无水乙醇或异丙醇沉淀上清液，最后得到DNA。
三、试剂和器材：
试剂：1、CTAB分离缓冲液：（2%CTAB，1.4mol/LNaCL, 20mmol/LEDTA, 100mmol/LTris-HCL(pH8.0), 0.1%PVP（吡咯烷酮）共100mL ，灭菌后变成澄清的溶液） 2、β-巯基乙醇 3、氯仿-异戊醇（24：1）4、无水乙醇或异丙醇 5、70%乙醇
器材：研钵，恒温水浴锅（37-100），离心机等
四、实验步骤
1、将1mLCTAB分离缓冲液加入2mL离心管中，置于65℃水浴中预热。
2、称取1.0g叶片，置于预冷的研钵中，尽快将叶片研碎。
3、将研磨样品直接加入预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻转动使之混匀。
4、 样品于65℃保温20-30分钟。
5、 加等体积（1mL）的氯仿-异戊醇，轻轻颠倒混匀。
6、 室温下10000rpm离心10分钟。
7、 用一开口较大的滴管将上层水相吸入另一干净的离心管中，加入2倍体积冷的无水乙醇或2/3体积的异丙醇，轻轻混匀，使核酸沉淀下来。（有些情况下，这一步可以产生用玻璃棒搅起来的长链DNA，或者是云雾状的DNA，如果看不到DNA，样品则可以在室温下放置数小时甚至过夜）。
8、DNA的收集：室温下12000rpm离心10分钟。收集沉淀
9、洗涤—用70%乙醇洗涤沉淀两次，按照（8）法重新收集核酸
10 、将DNA沉淀溶于1~1.5mL无离子水中，分装后—20℃保存备用。
注意；所有操作均须温和，避免剧烈震荡。
实验四 PCR基因扩增植物基因
一、实验目的
学习PCR反应的基本原理与实验技术,掌握PCR仪的规范用法和注意事项。
二、实验原理
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。将待扩增的DNA片断和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2的n次方倍。该技术已成为分子生物学中一种有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。
PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。整个扩增过程分三步：①变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链；②退火，突然降低温度后模板DNA引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度、结构简单等特点，主要的结合发生在引物与模板之间；③延伸，在DNA聚合酶及镁离子等的存在条件下，从引物的 3 ′端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新的DNA链。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量就增加一倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。一般设置25～40个循环。 PCR原理图示说明如下：
三、实验仪器
基因扩增仪（PCR仪）， 移液器，吸头，吸头盒，EP管（PCR管）
四、实验试剂
10×PCR缓冲液(含Mg2＋) ， 4种dNTP， Taq酶，DNA样，上下游引物，
五、实验步骤
1、PCR反应体系的配制
按顺序向PCR管中依次加入混匀：
物质 |
ddH2O |
DNA 样品 |
10×PCR 缓冲液 |
dNTP |
引物I |
引物Ⅱ |
Taq酶 |
体积(μl) |
13.5 |
2 |
2 |
2 |
1.6 |
0.4 |
0.1 |
2、PCR反应参数设置
(1) 94℃预变性3min
(2) 94℃变性30sec，50℃退火30sec，72 ℃延伸1min，循环35次。
(3)72 ℃延伸7min。 (4) 4℃保存
3、琼脂糖凝胶电泳检测PCR
取10μl PCR扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测。保持电流40mA。电泳结束后，用EB染色15min，紫外灯下观察结果。
六、结果分析
实验五 DNA的琼脂糖凝胶电泳分离植物DNA
一、实验目的
学习和掌握鉴定DNA的琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。
二、实验原理
在碱性溶液中DNA带负电荷，在电场作用下可以从负极向正极移动。电泳时，由于琼脂糖凝胶具有一定的孔径，长度不同的DNA分子所受凝胶的阻滞作用大小不一，因此迁移的速率也不同，因此可以按照相对分子质量大小得到有效分离。相对分子质量越小，迁移越快、相对分子质量越大，迁移越慢。DNA的构象对迁移速度也有一定的影响，向阳极迁移的速度超螺旋大于线状，线状大于开环。电压在一定的范围，线状DNA片段的迁移速率与所加的电压成正比。为了使分辨效果更好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm，因此，我们可以利用这些特性通过琼脂糖凝胶电泳，区别不同相对分子质量的DNA片段。溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中，在紫外光的照射下，插入溴化乙锭的DNA分子发出橙红色荧光，所以溴化乙锭可作为荧光指示剂指示DNA的含量及位置。
三、实验材料、试剂及器材
1、材料：实验三提取DNA和实验四扩增DNA
2、试剂：琼脂糖，Goldview(EB替代品) 1×TAE[50×TAE(配制：242g Tris碱，57.1mL冰乙酸、l00mL。O.5mol/L EDTA(pH 8．O)])， DNA Marker；加样缓冲液（50%甘油+0.25％溴酚蓝、40％(m/V)蔗糖水溶液）
3、器材：电泳仪、水平电泳槽、电子天平、微量移液器等。
四、实验步骤
1、琼脂糖凝胶的制备：称取琼脂糖1g，加入10mL 1×TAE电泳缓冲液，再加蒸馏水90 mL，加热使琼脂糖完全溶解。配制成1%琼脂糖凝胶，稍凉后加入配好的Goldview数滴。将琼脂糖凝胶倒入制胶模具，插入梳子。冷凝后拨出梳子，将凝胶放入电泳槽中。
2、加样：取样品溶液20μl，加入1/5体积的加样缓冲液。混匀后，将溶液加到样品孔中。
3、电泳：采用1-5V/cm的电压（长度以两个电极之间的距离计算），根据指示剂溴酚蓝电泳在凝胶的中下段时停止电泳。
4、看胶：用紫外检测仪观察结果并记录
五、结果与分析
实验注意事项
(1)取出梳子之前，一定要耐心等待琼脂糖凝胶凝固。
(2)点样要细心，以免点样枪头刺破凝胶。
(3)电泳时，电极一定要连接正确。
(4)染色剂是强诱变剂，有毒性，与该溶液接触时必须戴一次性手套，使用后的废液不可随意丢弃。
实验六 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
一、实验目的：通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞制备及转化的方法和技术。
二、实验原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态称感受态。其原理是细菌处于0℃、CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA质粒。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型得到表达，然后将此细菌培养物涂在选择性培养基上。
三、仪器、材料和试剂：
（一）仪器： 1.超净工作台 2.离心机 3.恒温摇床 4.高压灭菌锅 5.移液枪 6.振荡器 7.天平 8.恒温水浴 9.离心管 10.锥形瓶
（二）材料： 1.大肠杆菌DH5α 2.氯化钙 3.胰蛋白胨 4.氯化钠 5.酵母提取物 6.琼脂粉 7.羧苄青霉素 8.NaOH 9.pUC-18质粒DNA
（三）试剂：
1. 0.1mol/l CaCl2溶液 2. LB液体培养基 3. LB固体培养基 4. 50mg/ml羧苄青霉素。5.70%酒精
四、实验步骤：
（一）大肠杆菌感受态的制备
1.从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于3ml LB液体培养基的试管中，37℃震荡培养过夜。
2.取1 ml菌液转接到一个含有50ml LB液体培养基的锥形瓶中，37℃震荡培养2-3h（此时，A600应在0.4-0.5之间，细胞数务必﹤108/ml，此为实验成功的关键）。
3.用移液枪取1.5ml菌液转移到1.5ml离心管中，冰上放置10min。（每组做两管）
4.离心10min（4000r/min）。
5.倒出培养液，将管倒置1min，以使培养液流尽。
6.用冰冷的0.1mol/l CaCl2 200µl悬浮沉淀（用振荡器），立即放在冰上保温30min。
7.低温离心10min（4000r/min），回收细胞。
8.用冰冷的0.1mol/l CaCl2 200µl悬浮细胞（保存）。
9.分装细胞，毎200ul一份，此细胞为感受态细胞。
（二）质粒DNA的转化
1.取200ul新鲜制备的大肠杆菌感受态细胞，加入质粒DNA20µl混匀，冰上放置30min。
2.将管放到42℃保温90s。 3.冰浴2 min。
4.毎管加800 µl LB液体培养基，37℃培养1h（150 r/min）。
5.将适当体积（200µl）的复苏细胞，涂布在含有羧苄青霉素的LB培养皿中，正置平皿30min。（熔化LB固体培养基，要先30s，再5s，5s，然后加入50µl羧苄青霉素，倒平板，20min后推平板）
6.倒置平皿37℃培养12-16h，出现菌落。（在恒温培养箱中）
五、实验结果：
在含有羧苄青霉素的琼脂糖平板上出现菌落，该菌落即为含有pUC-18质粒的大肠杆菌菌落。出现的菌落涂布均匀，为白色米粒状。
教学大纲